Fluoreszenzfarbstoffe

Fluoreszenzfarbstoff aus der Seeanemone Entacmaea quadricolor

Aus dem Ulmer Aquarium in die Biotechnologie

Dr. Jörg Wiedenmann, Universität Ulm

Entwicklung leistungsfähiger Werkzeuge für die Lebenswissenschaften

Schon im alten Rom war das Phänomen der Biolumineszenz bekannt. So beschrieb Plinius der Ältere im ersten Jahrhundert nach Christus das helle Leuchten einiger Quallenarten. Jedoch erst vor wenigen Jahren haben lichtemittierende Proteine das Interesse der biomolekularen Forschung auf sich gezogen. Das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus der im Pazifik vorkommenden leuchtenden Qualle Aequorea victoria hat dabei eine Pionierrolle gespielt. Es ist ein kleines Protein, dessen Polypeptidkette eine zylinderförmige Struktur bildet, die im Inneren den lichtemittierenden Farbstoff enthält. Der Farbstoff bildet sich in einer Oxidationsreaktion durch Autokatalyse (Tsien, 1998). Das Leuchten der Qualle beruht auf einer chemischen Reaktion bei der sogenanntes »kaltes Licht« entsteht. Die freiwerdende Energie aus dieser Reaktion wird allerdings im Tier nicht direkt in Form von Licht abgegeben, sondern zunächst auf GFP übertragen. Das Protein strahlt nach dieser Aktivierung grünes Licht aus. Die Energie, die GFP zum Leuchten anregt, muss jedoch nicht zwingend aus einer chemischen Reaktion stammen. Auch die Bestrahlung mit ultraviolettem oder blauem Licht führt zur Abgabe von grünem Licht. Bei diesem als Fluoreszenz bezeichneten Vorgang wird das eingestrahlte kurzwellige Licht in Licht von längerer Wellenlänge umgewandelt. Dieses physikalische Phänomen ruft auch das geheimnisvolle grüne oder rote Leuchten bestimmter Nesseltiere im Aquarium unter blauer Beleuchtung hervor. In der Forschung werden Fluorenzfarbstoffe wie GFP zu Markierungszwecken eingesetzt.


Anwendung fluoreszierender Proteine in der Wissenschaft

In den vergangenen fünf Jahren hat GFP in viele Bereiche der lebenswissenschaftlichen Forschung Einzug gehalten, zum Beispiel in Studien der intrazellulären Proteinlokalisation. Hierbei wird die DNA, die für ein zu untersuchendes Protein kodiert, mit Hilfe von gentechnischen Methoden mit der GFP-kodierenden DNA verknüpft und dieses künstliche Gen in eine Zelle eingebracht. Die beiden Proteine werden nun von der Zelle als »Tandem« hergestellt. Wenn das zu untersuchende Protein in ein bestimmtes Zellkompartiment wandert, so schleppt es den fluoreszierenden Partner mit sich. Dadurch kann die Wanderung des Proteingespanns in der lebenden Zelle unter dem Fluoreszenzmikroskop annähernd in Echtzeit verfolgt werden, ohne daß aufwendige Anfärbetechniken angewendet werden müssen. Ein weiteres Beispiel für GFP-Anwendung sind Studien der Genaktivität. Gene besitzen regulierende Einheiten, welche die Expression der vom Gen kodierten Proteine steuern. Will man wissen, unter welchen Bedingungen ein Gen aktiv ist, wird wiederum ein künstliches Gen in eine Zelle eingeschleust, bei dem die regulierende Einheit von Interesse mit der GFP-kodierenden DNA gekoppelt ist. Wenn in der Zelle Bedingungen herrschen, die das zu untersuchende Gen »anschalten«, wird das GFP hergestellt, und die Aktivität des Gens kann direkt an der gesteigerten Fluoreszenz der Zelle abgelesen werden. Wichtige Anwendungen finden sich in der klinischen Forschung in den Bereichen Medikamentenentwicklung und -erprobung, AIDS- und Krebsforschung sowie Gentherapie. GFP ist in vielen Organismen erfolgreich exprimiert worden. Die Herstellung grün fluoreszierender Mäuse hat zu großem Aufsehen in den Medien geführt. Probleme verbinden sich damit, daß GFP aus Aequorea victoria in gewissem Grade zelltoxisch ist und die Genregulation beeinflussen kann.


Red is beautiful

Die Verwendung fluoreszenter Farbstoffe in der lebenswissenschaftlichen Forschung und Entwicklung nimmt gegenwärtig stark zu, wie sich anhand der Zahl einschlägiger Publikationen belegen läßt. Der Handel mit fluoreszenten Farbstoffen und den zugehörigen Nachweisgeräten ist zur Zeit schon ein beachtlicher Wirtschaftsfaktor, und seine Bedeutung wird weiter wachsen. Um eine breite Palette von Anwendungen zu erschließen, sind in den letzten Jahren weltweit große Anstrengungen unternommen worden, die Fluoreszenzeigenschaften von GFP durch protein engineering weiter zu optimieren. Insbesondere wurde versucht, die Lichtabsorption und -emission in den langwelligeren, roten Spektralbereich zu verschieben, da die grüne Lichtemission aus physikalischer Sicht in verschiedener Hinsicht nicht optimal ist: Grün fluoreszierende Proteine müssen mit energiereichem, ultraviolettem oder blauem Licht angeregt werden, was zu Zellschädigungen führen kann. Dies stellt einen entscheidenden Nachteil für einen in-vivo-Marker dar. Rot emittierende Varianten könnten hingegen durch energieärmeres, grünes oder orangefarbenes Licht angeregt werden. Die unspezifische Eigenfluoreszenz von Zellen, die bei der mikroskopischen Beobachtung der Zellen einen Untergrund hervorruft, ist im roten Spektralbereich deutlich niedriger als im blau-grünen. Die Streuung nimmt in Geweben mit steigender Wellenlänge ab; damit zusammenhängend erhöht sich die Nachweisbarkeit der Markersubstanz. Ferner steigt die Empfindlichkeit halbleiterbasierter optischer Nachweissysteme im roten Spektralbereich stark an. Alle Versuche, durch gentechnische Modifikationen am Aequorea-GFP dauerhaft rot fluoreszierende Proteine zu gewinnen, sind bisher fehlgeschlagen. Dann hat die Natur gezeigt, daß es trotzdem möglich ist: im Jahr 1996 entdeckten wir, daß fluoreszierende, zur GFP-Familie gehörende Proteine mit den unterschiedlichsten spektralen Eigenschaften in nicht-biolumineszenten Nesseltieren vorkommen. Überraschenderweise wurden darunter auch Spezies mit roter Färbung gefunden (Wiedenmann, 1997; Wiedenmann et al., 1999, Wiedenmann et al., 2000). Unabhängig davon wurden einschlägige Arbeiten von Lukyanov und Mitarbeitern von der Russischen Akademie der Wissenschaften durchgeführt und von einer amerikanischen Firma zügig kommerziell umgesetzt (Matz et al., 1999). Bei diesen natürlich vorkommenden rot fluoreszierenden Proteinen wirken sich allerdings die langsame Reifung des Fluorophors, die Tendenz zur Oligomerisierung und die teilweise Bildung von Aggregaten für viele Anwendungen negativ aus. Die langsame Reifung ist in Experimenten zur Untersuchung der Genaktivität von Nachteil, da die Aktivität des Gens erst mit der entsprechenden Verzögerung nachgewiesen werden kann. Im Falle einer Oligomerisierung lagern sich in der Regel vier oder mehr einzelne Moleküle des Markerproteins aneinander. Bei Studien der Proteinlokalisation ist jedes dieser Moleküle zusätzlich mit dem zu untersuchenden Protein verknüpft. Auf diese Weise entstehen hochmolekulare Komplexe, die häufig nicht mehr die natürliche Lokalisation des Fusionspartners anzeigen. Darüber hinaus kann auf diese Weise auch die Funktionalität des Fusionsproteins verlorengehen. In aktuellen Berichten der vergangenen Monate wurde gezeigt, wie diese Nachteile zum Teil mit Hilfe der Gentechnik behoben werden können.


Fluoreszierende Proteine in Nesseltieren

In einer Kooperation zwischen den Fächern Biologie und Physik haben wir uns zum Ziel gesetzt, fluoreszierende Proteine mit verbesserten Eigenschaften zu entwickeln. In diesem Projekt der Abteilungen Allgemeine Zoologie und Endokrinologie sowie Biophysik der Universität Ulm werden natürlich vorkommende GFP-Varianten isoliert und eingehend charakterisiert. Hierzu werden zunächst Nesseltiere bei Tauchgängen im Meer gesammelt. Daneben kann auch der Beifang von Fischkuttern im Mittelmeer interessante Objekte liefern. Im Rahmen einer Zusammenarbeit der Abteilung Allgemeine Zoologie und Endokrinologie mit Dr. Anya Salih von der Universität Sydney werden in Australien farbige Korallen des Great-Barrier-Riffs auf das Vorhandensein geeigneter Proteine untersucht. Vielversprechende Kandidaten werden für weitere Untersuchungen in der Aquarienanlage der Abteilung Allgemeine Zoologie und Endkrinologie gehältert, um GFP-Varianten mit photophysikalisch optimalen Eigenschaften zu identifizieren und die zugehörigen Gene zu isolieren. Die strukturellen Eigenschaften der Proteine werden durch Kristallstrukturanalyse an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble, aufgeklärt. Hierbei arbeitet die Abteilung Biophysik der Universität Ulm unter der Leitung von Prof. Ulrich Nienhaus mit Prof. Beatrice Vallone von der Universität Rom (La Sapienza) zusammen. Ziel dieser Arbeiten ist ein besseres Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehungen in dieser Proteinfamilie, um optimale Proteindesigns für potentielle Anwendungen entwickeln zu können.


Ein neuer roter Farbstoff

Unserer Gruppe in Ulm gelang kürzlich die Isolierung und Charakterisierung eines rot fluoreszierenden Proteins (eqFP611) aus Entacmaea quadricolor, das die bislang langwelligste Emission und größte Stokes-Verschiebung aller natürlich vorkommenden GFP-Varianten aufweist. Die Stokes-Verschiebung gibt den Abstand zwischen der Wellenlänge an, bei der das Leuchten des Farbstoffs am besten angeregt wird, und der Wellenlänge, bei der das meiste Licht abgestrahlt wird. Eine große Stokes-Verschiebung ist von Vorteil, um beim Nachweis des Markerproteins in einer Zelle unter dem Fluoreszenzmikroskop die Leuchtkraft des Farbstoffs optimal ausnutzen zu können. Das Protein zeichnet sich darüberhinaus durch eine Reihe weiterer positiver Eigenschaften aus, insbesondere die schnelle Reifungsgeschwindigkeit und die geringe Oligomerisierungstendenz. Gegenwärtig wird intensiv an der photophysikalischen Charakterisierung dieses Proteins gearbeitet, wobei die in der Abteilung Biophysik entwickelten ultrasensitiven Verfahren der Fluoreszenzspektroskopie zum Einsatz kommen, mit denen einzelne Proteinmoleküle untersucht werden können. Daneben wird die gentechnische Optimierung des neuen Markerproteins vorangetrieben. Dieses Projekt wird von der Landesstiftung Baden-Württemberg im Rahmen des Elite-Postdoktoranden-Programms gefördert. Wesentliche Teile der bereits vorliegenden Ergebnisse sind in der Zeitschrift Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (3. September 2002) erschienen (Wiedenmann et al., 2002).


Die Herkunft von eqFP611

Die Kupferanemone Entacmaea quadricolor, aus der das vielversprechende Protein eqFP611 isoliert wurde, ist hauptsächlich in den Gewässern um Australien, Indonesien und im Roten Meer zu finden. Das untersuchte Tier stammt von einem Exemplar ab, das bereits vor vielen Jahren nach Deutschland eingeführt wurde. Diese Anemone erwies sich damals als dankbarer Pflegling und produzierte durch Längsteilung unzählige »Nachkommen«. Dadurch fand der Klon im Ulmer Raum schnell eine weite Verbreitung und wurde auch überregional als die »Ulmer Anemone« bekannt. Über den Vorstand, Herrn Bernd Gößele, besteht eine langjährige Verbindung zwischen unserer Gruppe und der Gesellschaft für Meeresaquaristik Ulm e.V. Ihm ist es auch zu verdanken, dass Entacmaea quadricolor einer eingehenden biochemische Untersuchung der Farbstoffe unterzogen werden konnte.

Bilder

Aus dieser Kupferanemone (Entacmaea quadricolor) aus dem Ulmer Aquarium wurde das rot fluoreszierende Protein eqFP611 isoliert.

Aufgrund der Markierung mit eqFP611 aus E. quadricolor zeigen diese menschlichen Tumorzellen unter dem Fluoreszenzmikroskop ein rotes Leuchten. (Foto: Andreas Girod, EMBL Heidelberg)

Kristalle von eqFP611. Aus hochreinen Lösungen des Farbstoffes eqFP611 wurden diese Proteinkristalle gezüchtet. An solchen Kristallen kann mit Hilfe der Röntgen-Analyse die dreimensionale Stuktur des Proteins ermittelt werden.

Das Fluoreszenzspektrum von eqFP611 aus Entacmaea quadricolor. Das Anregungsspektrum (linke Kurve) macht deutlich, dass die rotverschobene Emission des Proteins mit einem Maximum bei 611 nm (rechte Kurve) am besten durch grünes und gelbes Licht (Maximum: 559 nm) hervorgerufen wird.

Literatur

Kontaktadresse

Dr. Jörg Wiedenmann
Abt. Allgem. Zoologie & Endokrinologie
Universität Ulm
Albert-Einstein-Allee 11
89069 Ulm
Germany
e-mail: joerg.wiedenmann@biologie.uni-ulm.de
Tel.: 0049 (0)731 502-2591 (-2584)
Fax.: 0049 (0)731 502-2581